Исследование геномов
Первые исследования структуры геномов были основаны на изучении реассоциации геномной ДНК. Суть метода следующая. Сначала ДНК клетки гидролизуют до коротких фрагментов (примерно 400 п.н.), затем нагревают до 100 градусов: при нагревании ДНК денатурирует на одноцепочечные фрагменты. Затем смесь постепенно охлаждают, и одноцепочечные фрагменты начинают реассоциировать, т.е. образовывать снова двуцепочечные молекулы с комплементарными фрагментами.
Скорость реассоциации зависит от вероятности встретить комплементарный участок, что, в свою очередь, зависит как от количества точно таких же последовательностей в пробирке, так и от их концентрации в общем пуле фрагментов. Данные такого вида удобно представлять в виде графика, где на оси Y отложена доля реассоциированной (двуцепочечной) ДНК, а по оси X – начальная концентрация одноцепочечной ДНК (С0) умноженная на время, прошедшее с начала реакции. Известно, что на основе данного графика можно оценить размер генома исследуемого организма.
Вопрос 1. На графике 1 показаны кривые реассоциации ДНК трех организмов (E.coli, теленок, фаг Т4) и коротких синтетических фрагментов поли А – поли У, а также размер их геномов (стрелки сверху). Сопоставьте кривые 1-4 с названиями образцов. Поясните, почему чем больше геном, тем кривая реассоциации располагается правее.
В большом геноме много разных фрагментов ДНК, поиск гомологичного занимает гораздо больше времени. (1 балл) или Также можно предположить, что изначальная концентрация фрагментов будет выше, так как геном больше. (1 балл)
4 б
Вопрос 2. Оказалось, что кривые реассоциации прокариотических и эукариотических организмов различаются по наклону к оси Х. На графике 2 определите, какая буква соответствует ДНК бактерии, а какая – эукариоты (теленка). Ответ поясните.
ДНК бактерии А
ДНК теленка Б
E.coli содержит в основном уникальные последовательности – долго ищут друг друга (график А), а ДНК теленка – есть много повторов – которые быстро реассоциируют (график Б). (2 балла). За объяснение про размер генома – 1 балл
Вопрос 3. У ДНК организма Б на графике выделяются три области (отмечены цифрами) с разными скоростями ассоциации. Как вы считаете, ДНК каких элементов генома реассоциирует на этих участках? Укажите характерную особенность этих элементов и приведите примеры.
Известно, что исследование реассоциации молекул ДНК можно использовать для определения степени родства различных организмов. Для этого смешивают вместе ДНК двух организмов, родство которых хотят определить, затем нагревают, чтобы ДНК денатурировала, и остужают для того, чтобы произошла гибридизация между гомологичными последовательностями. Исследователь решил определить родство видов A, B и С на основе этого подхода.
Образец 1: ДНК вида А.
Образец 2: ДНК вида А + ДНК вида В.
Образец 3: ДНК вида А + ДНК вида С.
После приготовления образцов и нагревания до температуры, когда вся ДНК стала одноцепочечной, каждый образец был медленно охлаждён для проведения гибридизации цепей ДНК. Далее при постепенном нагревании исследователь фиксировал процентное содержание одноцепочечной ДНК в образцах
Результаты приведены на графике 3.
6 б
Вопрос 4. Почему для гибридизации цепей ДНК охлаждение образцов было медленным, а не резким?
Потому что быстрое охлаждение приводит к неспецифической гибридизации цепей, а для получения интерпретируемых данных необходима максимально специфичная гибридизация гомологичных участков Если в качестве причины указано снижение скорости реакции – 1 балл.
2 б
Вопрос 5. Предложите технологию определения содержания двуцепочечной ДНК в образцах, с помощью которой можно получить график выше? Опишите предложенный способ и его суть.
Можно использовать интеркалирующие флуоресцентные красители и при нагревании фиксировать постепенное уменьшение свечения при денатурации ДНК. Также засчитывались методы: гельэлектрофорез; методы, основанные на определении массы.
2 б
Вопрос 6. На основе имеющихся данных постройте кладограмму, отражающую родство видов А, В и С. Объясните своё решение.
Должно быть изображено, что виды А и В родственны, а вид С не родственен им обоим, так как гибридные молекулы из нитей ДНК видов А и С плавятся при низкой температуре, что означает, что у них низкое сходство в последовательности (мало гомологичных участков). Обратная ситуация с гибридами нитей ДНК видов А и В, температура плавления которых близка к температуре плавления геномной ДНК вида А, что говорит о том, что виды А и В родственны.
4 б