Задача
У бактерий для защиты от вирусов есть специальные ферменты –
рестриктазы, расщепляющие ДНК по симметричным последовательностям. Они называются по первым буквам латинского названия рода и вида бактерии, например, Bgl – рестриктаза из гнилостной бактерии Bacillus globigii. Рестриктаза Bgl расщепляет последовательность:
5'----АГАТЦТ-----3' \rightarrow 5'----А ГАТЦТ-----3'
3'----ТЦТАГА-----5' 3'----ТЦТАГ А-----5'.
На концах полученных фрагментов ДНК всегда будут одинаковые и комплементарные друг другу одноцепочечные участки ДНК, называемыми «липкими концами», т.к. они могут соединяться между собой за счёт образования комплементарных пар оснований. Если такой комплекс обработать ферментом ДНК-лигазой, произойдёт ковалентное соединение фрагментов, соединённых «липкими концами». При таком сшивании соединение концов одного фрагмента при его длине более 900 нуклеотидных пар происходит в 10 раз чаще, чем соединение концов двух разных фрагментов. Соединение фрагментов происходит случайным образом.
Плазмида pСО36 несёт гены устойчивости к канамицину и пенициллину и состоит из 3420 пар нуклеотидов. Рестриктаза Bgl расщепляет эту плазмиду только по гену устойчивости к пенициллину в начале этого гена. В районе расщепления ДНК имеет последовательность нуклеотидов:
5'-ТАГАТЦТГАААТГААТААГГТЦАГГГГГАЦТААГААТЦАГАТЦТГГТГЦЦТАЦАГЦТ-3'.
3'-АТЦТАГАЦТТТАЦТТАТТЦЦАГТЦЦЦЦТГАТТЦТТАГТЦТАГАЦЦАЦГГАТГТЦГА-5'
Плазмиду обработали рестриктазой Bgl. Полученную смесь фрагментов ДНК обработали ДНК-лигазой. Полученные ДНК смешали с клетками бактерий без плазмид и чувствительных к антибиотикам. В часть клеток проникла ДНК плазмиды и изменила их свойства. Полученные клетки высеяли на твёрдую питательную среду без антибиотиков. Было получено 21356 колоний. Клетки из каждой колонии пересеяли на среду, содержащую канамицин, на которой рост дали 282 колонии. Клетки из этих колоний, пересеяли на среду с пенициллином. На этой среде выросло 32 колоний. Из них выделили плазмидную ДНК, она была представлена двумя разными по длине формами, причём в каждой колонии был только один вид плазмиды.
1. Какова эффективность трансформации клеток плазмидой (в % трансформированных клеток)?
2. Как можно объяснить разную длину плазмид в устойчивых к пенициллину колониях?
3. Сколько размерных классов плазмид можно найти в колониях, устойчивых к канамицину?
Сначала найдём место расщепления плазмиды рестриктазой Bgl.
5'–ТАГАТЦТГАААТГААТААГГТЦАГГ ГГ ГАЦТААГААТЦАГАТЦТГГТГЦЦТАЦАГЦТ–3'
3'–АТЦТАГАЦТТТАЦТТАТТЦЦАГТЦЦЦЦЦТГАТТЦТТА ГТЦТАГАЦЦАЦГГАТГТЦГА–5'
Таких участков оказывается два. В результате расщепления из плазмиды вырезается короткий фрагмент:
5'-ГАТЦТГАААТГААТААГГТЦАГГГГГАЦТААГААТЦА-3' 37 пар нуклеотидов
3'- АЦТТТАЦТТАТТЦЦАГТЦЦЦЦТГАТТЦТТАГТЦТАГ-5'
Остаётся укороченная линейная ДНК, содержащая интактный ген устойчивости к канамицину и расщеплённый ген устойчивости к пенициллину.
5'-ГАТЦТГГТГЦЦТАЦАГЦТ ТА-3'
3'- АЦЦАЦГГАТГТЦГА \leftarrow 3383 пары \rightarrow АТЦТАГ-5'
Нашли сайт рестрикции, выделили фрагмент – 2 балла
При сшивании липких концов ДНК-лигазой наиболее часто будут соединяться концы этой молекулы и образовываться кольцо длиной 3383 пары нуклеотидов. Такая ДНК будет сообщать клеткам устойчивость к канамицину и не даст устойчивости к пенициллину. Второй фрагмент из- за небольшой длины не может замкнуться в кольцо.
Второй вариант лигирования приводит к сшиванию липких концов двух фрагментов. Он
происходит примерно в 10 раз реже, а после сшивки вторая пара липких концов скорее всего также, как и исходный фрагмент замкнётся в кольцо. Таких колец из пары фрагментов может образоваться 4 вида: димеры большого фрагмента в двух разных ориентациях (правый конец с левым концом второго фрагмента и левый конец с правым концом второго фрагмента или правый с правым и левый с левым) и соединения большого и малого фрагмента в двух разных ориентациях (вариант исходной плазмиды и инверсия малого фрагмента). Из них только в варианте исходной плазмиды восстанавливается устойчивость к пенициллину. Линейная молекула, образованная сшиванием двух фрагментов, может присоединить ещё один фрагмент с ещё в 10 раз меньшей частотой. Такие фрагменты в дальнейшем будут циклизоваться в плазмиды трёх размеров: из трёх больших фрагментов, из двух больших и одного малого и одного большого и двух малых. Три малых фрагмента дадут короткую последовательность, которая не сможет замкнуться в кольцо и существовать в клетке. В каждом размерном классе будет несколько вариантов с разной ориентацией фрагментов. Только в одном из них восстановится ген устойчивости к пенициллину: правый конец большого фрагмента соединяется с левым концом малого фрагмента, а правый конец малого фрагмента – с левым концом второго большого фрагмента, а оставшиеся концы двух больших фрагментов соединяются с образованием кольцевой плазмиды длиной 6803 пары нуклеотидов. Доля таких молекул будет менее 1% всех плазмид.
Вероятность образования плазмид из 4 и более фрагментов ещё на порядок ниже и их обнаружение при данном числе полученных трансформированных клеток нереально.
1. Так как расщепление рестриктазой не затрагивает ген устойчивости к канамицину, все клетки, в результате трансформации получившие любую плазмиду, будут устойчивы к канамицину и вырастут на среде с этим антибиотиком. Таким образом из 21356 выросших колоний плазмиду получили 282, выросших на канамицине. Эффективность трансформации представляет долю трансформированных клеток от общего их числа, т.е. 282:21356*100%=1,32%.
2. На канамицине могут вырасти только те клетки, в которые попали плазмиды, в которых в результате лигирования восстановится последовательность нуклеотидов в гене устойчивости к канамицину, расщеплённая рестриктазой. Остальные плазмиды, полученные по приведённой методике, будут содержать либо ген с выщепленным коротким фрагментом, что приведёт к сдвигу рамки считывания (т.к. число удалённых нуклеотидов не кратно трём), либо, при инверсии короткого фрагмента, к появлению стоп-кодонов т.е. прекращению синтеза белка. Таким образом большинство полученных плазмид не обеспечат устойчивости к канамицину.
Рост на канамицине могут обеспечить только плазмиды, несущие восстановленную последовательность гена устойчивости. Такие плазмиды могли образоваться из одного большого и одного малого фрагмента (3420 пар, исходная плазмида) или из двух больших и одного малого (6803 пары, начало и конец гена из разных копий большого фрагмента).
3. Получается 1 размер из одного большого фрагмента, два размерных класса из двух фрагментов (2 больших и большой и малый) и три размерных класса из трёх фрагментов (три больших, два больших и один малый, один большой и два малых), то есть 6 размерных классов. (В реальности различить по длине плазмиды, отличающиеся на длину малого фрагмента, т.е. менее чем на 1%, невозможно. Поэтому в эксперименте, например на электрофореграмме, будут видны лишь три размерных класса, соответствующие 1, 2 или 3 копиям большого фрагмента. Школьники скорее всего этого не знают, но могут догадаться.)