Задача
У бактерий для защиты от вирусов есть специальные ферменты – рестриктазы, расщепляющие ДНК по симметричным последовательностям. Они называются по
первым буквам латинского названия рода и вида бактерии, например, Kpn – рестриктаза из Klebsiella pneumoniae, возбудителя одной из форм пневмонии. Рестриктаза Kpn расщепляет последовательность:
5'-ГГТАЦЦ-3' \rightarrow 5'-Г ГТАЦЦ-3'
3'-ЦЦАТГГ-5' 3'-ЦЦАТГ Г-5'
На концах полученных фрагментов ДНК всегда будут одинаковые и комплементарные друг другу одноцепочечные участки ДНК, называемыми «липкими концами», т.к. они могут соединяться между собой за счёт образования комплементарных пар оснований. Если такой комплекс обработать ферментом ДНК-лигазой, произойдёт ковалентное соединение фрагментов, соединённых «липкими концами». При таком сшивании соединение концов одного фрагмента при его длине более 900 нуклеотидных пар происходит в 10 раз чаще, чем соединение концов двух разных фрагментов. Соединение фрагментов происходит случайным образом.
Плазмида pLG325 несёт гены устойчивости к канамицину и тетрациклину и состоит из 4620 пар нуклеотидов. Рестриктаза Kpn расщепляет эту плазмиду только по гену устойчивости к канамицину в начале этого гена. В районе расщепления ДНК имеет последовательность нуклеотидов:
5'-ТААЦТГГТАЦЦТААТГАААЦТААЦТТГГАЦЦГЦТАГАГАГГТАЦЦАГГАГАЦГТАТЦ-3'.
3'-АТТГАЦЦАТГГ АТТАЦТТТ ГАТТ ГААЦЦТГГЦГАТЦТЦТЦЦАТГГТЦЦТЦТГЦАТАГ -5'
Плазмиду обработали рестриктазой Kpn. Полученную смесь фрагментов ДНК обработали ДНК- лигазой. Полученные ДНК смешали с клетками бактерий без плазмид и чувствительных к антибиотикам. В часть клеток проникла ДНК плазмиды и изменила их свойства. Полученные клетки высеяли на твёрдую питательную среду без антибиотиков. Было получено 18356 колоний. Клетки из каждой колонии пересеяли на среду, содержащую тетрациклин, на которой рост дали 143 колонии. Клетки из этих колоний пересеяли на среду с канамицином. На этой среде выросло 16 колоний. Из них выделили плазмидную ДНК, она была представлена двумя разными по длине формами, причём в каждой колонии был только один вид плазмиды.
1. Какова эффективность трансформации клеток плазмидой (в % трансформированных клеток)?
2. Как можно объяснить разную длину плазмид в устойчивых к канамицину колониях?
3. Сколько размерных классов плазмид можно найти в колониях, устойчивых к каномицину?
Сначала найдём место расщепления плазмиды рестриктазой Kpn
Таких участков оказывается два. В результате расщепления из плазмиды вырезается короткий фрагмент длиной 34 пары нуклеотидов, представляющий собой участок гена устойчивости к канамицину:
Нашли сайт рестрикции, выделили фрагмент – 2 балла
Остаётся укороченная линейная ДНК, содержащая нерасщеплённый ген устойчивости к
тетрациклину и расщеплённый ген устойчивости к канамицину.
При сшивании липких концов ДНК-лигазой наиболее часто будут соединяться концы этой молекулы и образовываться кольцо длиной 4585 пар нуклеотидов. Такая ДНК будет сообщать клеткам устойчивость к тетрациклину и не даст устойчивости к канамицину. Второй фрагмент из-за небольшой длины не может замкнуться в кольцо.
Второй вариант лигирования приводит к сшиванию липких концов двух фрагментов. Он
происходит примерно в 10 раз реже, а после сшивки вторая пара липких концов скорее всего также, как и исходный фрагмент замкнётся в кольцо. Таких колец из пары фрагментов может образоваться 4 вида: димеры большого фрагмента в двух разных ориентациях (правый конец с левым концом второго фрагмента и левый конец с правым концом второго фрагмента или правый с правым и левый с левым) и соединения большого и малого фрагмента в двух разных ориентациях (вариант исходной плазмиды и инверсия малого фрагмента). Из них только в варианте исходной плазмиды восстанавливается устойчивость к канамицину.
Линейная молекула, образованная сшиванием двух фрагментов, может присоединить ещё один фрагмент с ещё в 10 раз меньшей частотой. Такие фрагменты в дальнейшем будут циклизоваться в плазмиды трёх размеров: из трёх больших фрагментов, из двух больших и одного малого, и одного большого и двух малых. Три малых фрагмента дадут короткую последовательность, которая не сможет замкнуться в кольцо и существовать в клетке. В каждом размерном классе будет несколько вариантов с разной ориентацией фрагментов. Только в одном из них восстановится ген устойчивости к канамицину: правый конец большого фрагмента соединяется с левым концом малого фрагмента, а правый конец малого фрагмента – с левым концом второго большого фрагмента, а оставшиеся концы двух больших фрагментов соединяются с образованием кольцевой плазмиды длиной 9205 пар нуклеотидов. Доля таких молекул будет менее 1% всех плазмид. Вероятность образования плазмид из 4 и более фрагментов ещё на
порядок ниже и их обнаружение при данном числе полученных трансформированных клеток нереально.
1. Так как расщепление рестриктазой не затрагивает ген устойчивости к пенициллину, все клетки, в результате трансформации получившие любую плазмиду, будут устойчивы к пенициллину и вырастут на среде с этим антибиотиком. Таким образом из 18356 выросших колоний плазмиду получили 143, выросших на пенициллине. Эффективность трансформации представляет долю трансформированных клеток от общего их числа,
т.е.143:18356*100%=0,78%.
2. На канамицине могут вырасти только те клетки, в которые попали плазмиды, в которых в результате лигирования восстановится последовательность нуклеотидов в гене устойчивости кэтому антибиотику, расщеплённому рестриктазой. Остальные плазмиды, полученные по приведённой методике, будут содержать либо ген с выщепленным коротким фрагментом, что приведёт к сдвигу рамки считывания (т.к. число удалённых нуклеотидов не кратно трём), либо, при инверсии короткого фрагмента, к появлению стоп-кодонов т.е. прекращению синтеза белка.
Таким образом большинство полученных плазмид не обеспечат устойчивости к канамицину.
Рост на канамицине могут обеспечить только плазмиды, несущие восстановленную последовательность гена устойчивости. Такие плазмиды могли образоваться из одного большого и одного малого фрагмента (4620 пар, исходная плазмида) или из двух больших и одного малого (9205 пар, начало и конец гена из разных копий большого фрагмента).
3. Получается 1 размер из одного большого фрагмента, два размерных класса из двух фрагментов и три размерных класса из трёх фрагментов, то есть 6 размерных классов. (В реальности различить по длине плазмиды, отличающиеся на длину малого фрагмента, т.е. менее чем на 1%, невозможно. Поэтому в эксперименте, например на электрофореграмме, будут видны лишь три размерных класса, соответствующие 1, 2 или 3 копиям большого фрагмента.