Генный портной
В этом задании вы можете попробовать себя в роли генного инженера. Одной из типичных технических задач в такой работе является перемещение участков ДНК, например, последовательностей каких-либо генов, из одних генетических конструкций в другие, такие как, например, плазмиды - кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, персистирующие и реплицируемые в клетках различных бактерий. Некоторые плазмиды могут персистировать и в клетках эукариот, однако там они обычно не реплицируются.
При "вырезании" участков ДНК, а также при их внедрении в, так называемые, плазмидные векторы, часто используют определенные ферменты, способные вносить разрывы в цепях молекулы ДНК в зависимости от наличия строго определённых последовательностей нуклеотидов. При этом обычно в районе разрезания формируются концевые одноцепочечные участки ДНК - «липкие концы» (некоторые из этих ферментов разрезают без образования «липких концов») (название данных ферментов нужно будет указать в ответах).
Итак, в ходе вашей работы как генного инженера появилась необходимость поместить в имеющуюся плазмиду ген зелёного флуоресцентного белка (GFP). Последовательность действий в общем виде состоит из следующих этапов:
1) Получить в достаточном количестве фрагмент ДНК, соответствующий гену GFP и необходимый для вставки в вектор — плазмиду.
2) Убедиться в точном соответствии нуклеотидной последовательности "вставки" ожидаемой последовательности.
3) Обработать вышеуказанными ферментами отдельно "вставку" и "плазмиду" для получения "липких концов". При этом обработка производится таким образом, чтобы "липкие концы" вставки были комплементарны таковым у плазмиды. При такой обработке плазмиды (разрезании двумя ферментами) в реакционной смеси окажутся два её фрагмента (линейные молекулы ДНК). Меньший из этих фрагментов будет просто отброшен, а больший использован для сшивания его концов с концами вставочного фрагмента. Превращение кольцевой ДНК плазмиды в линейную называем «линеаризацией».
4) Обработка смеси «порезанных» плазмиды и вставки ферментом ДНК-лигаза, катализирующим образование фосфодиэфирной связи между 5' и 3' концами двухцепочечных ДНК ("сшивает" одноцепочечные разрывы, остающиеся после комплементарного взаимодействия "липких концов"). В результате в смеси должны появиться целевые плазмиды со вставкой (восстанавливается кольцевая форма).
5) Для селективного накопления таких плазмид проводят их клонирование в бактериях (обычно E. coli) с последующим выращиванием проверенных клонов в большом объёме.
В нашем случае молекулы вставки получены в необходимых количествах заранее с добавленными на обоих концах дополнительными нуклеотидными последовательностями, не относящимися к кодирующей последовательности и не участвующими в экспрессии кодируемого гена (GFP), но содержащие в себе сайты узнавания вышеупомянутыми ферментами. Ниже на схеме представлена последовательность (не полная, только концевые участки) вставки. Пробелы между триплетами присутствуют только для удобства изучения последовательности.
Кроме того, имеется результат секвенирования (определение первичной последовательности ДНК) участка плазмиды, в который предполагается интегрировать вышеуказанный фрагмент ДНК. Было проведено секвенирование по Сэнгеру с помощью автоматического капиллярного секвенатора. На выходе получена секвенограмма в виде "сырой", непрочитанной программой хроматограммы, где пики четырёх цветов соответствуют различным нуклеотидам (см. легенду). На изображении 2 представлен интересующий участок секвенограммы плазмиды, на протяжении которого нужно осуществить вставку последовательности гена GFP.
Таблица 1. Сайты узнавания некоторых ферментов, позволяющих сайтспецифически разрезать молекулы двухцепочечной ДНК
Задание 1. Где в бактериальной клетке следует искать плазмидную ДНК? Несмотря на отсутствие репликации плазмид в клетках многоклеточных эукариотических организмов, некоторые из генов, кодируемых в плазмидах, могут там экспрессироваться (при искусственном введении плазмиды в такие клетки). Обычно это зависит от наличия в плазмиде перед геном соответствующего управляющего элемента, подходящего именно для эукариотических клеток. Назовите этот управляющий элемент.
В бактериальной клетке плазмидная ДНК может находиться только в цитоплазме. Данный элемент - промотор, в нашем случае - промотор, способный направлять экспрессию гена в клетках эукариот (такой как, например, CMV промотор).
Задание 2. В тексте задания были упомянуты ферменты бактерий, способные разрезать цепи ДНК при наличии в них соответствующих последовательностей (сайтов узнавания), специфических для каждого такого фермента. Назовите данные ферменты. Какую роль эти ферменты играют у бактерий?
Эндонуклеазы рестрикции. Разрушение экзогенной ДНК, например, для защиты от бактериофагов.
Задание 3. С учётом легенды к изображению 2 определите первичную нуклеотидную последовательность участка плазмиды, для которого на данном изображении представлена секвенограмма. Остатков каких нуклеотидов — пуриновых или пиримидиновых — больше в данной последовательности?
ATTCGCGAGAATTCTCTAGAGTCGACACTAGTGCGGATCCACGGGTGGCAT CC
Больше пуриновых (А и Г) — их 27, пиримидиновых (С и Т) - 26
Задание 4. Какие два энзима из доступных в лаборатории (представлены в таблице 1) необходимо использовать для обработки вставки (рис. 1) с тем, чтобы её можно было ввести в плазмидный вектор в пределах участка, представленного на секвенограмме (рис 2), учитывая, что управляющий элемент, упомянутый в вопросе 1, расположен слева от представленного на секвенограмме участка. Какие из этих ферментов необходимо использовать для обработки плазмиды?
Посмотрев на последовательность концевых регионов вставки (ген GFP) мы можем увидеть, что до первого триплета гена, кодирующего метионин, расположен единственный сайт узнавания — для рестриктазы XbaI, после стопкодона ТАА также находится единственный сайт узнавания — для рестриктазы BamHI. Теперь, посмотрев на последовательность, представленную на секвенограмме, мы также обнаружим эти два сайта узнавания — для XbaI левее и для BamHI — правее, а значит при разрезании плазмиды по этим сайтам, вставка гена произойдёт в нужном направлении.
Теми же ферментами.
Задание 5. В каких участках последовательности вставки можно произвести разрезание без ущерба для её функциональности в качестве гена, кодирующего синтез белка GFP. Что будет, если произвести «правый» разрез левее стоп-кодона?
На 5' конце до ATG в позиции 11 - 13, кодирующего стартовый метионин белка, на 3' конце - после стоп-кодона ТАА. Если разрез произойдёт до стоп-кодона, то некоторое количество кодонов из последовательности плазмиды (до ближайшего нового стоп-кодона), следующие за соответствующим разрезом в плазмиде, войдут в кодирующую последовательность гена, что приведёт к синтезу «неправильного» белка.
Задание 6. Учитывая, что общая длина плазмиды составляет 5031 п.н., укажите длину (по одной из цепей) полученных фрагментов после её разрезания: основной части плазмиды, которая будет сшиваться со вставкой, и участка между двумя сайтами распознавания для использованных разрезающих ферментов.
Длина малого (вырезаемого) фрагмента по любой цепи - 20 оснований («липкие» концы равны по длине) — это можно подсчитать исходя их расположения на секвенограмме найденных сайтов узнавания, длина большего фрагмента (линеаризуемая плазмида) - 5031 - 20 = 5011.
Задание 7. Сшивание линеаризованной плазмиды и вставки ферментом ДНКлигаза (лигирование) проводят с определенным молекулярным соотношением между сшиваемыми молекулами. Для дальнейших расчётов рассчитайте молярную массу плазмиды и вставки, помня, что она численно равна относительной молекулярной массе. Используйте следующие значения последней для дезоксирибонуклеотидов в составе двухцепочечной ДНК: A - 313.2 г/моль, G - 329.2 г/моль, C - 289.2 г/моль, T - 304.2 г/моль (вклад концевых фосфатов не учитываем, длины линейного фрагмента плазмиды, соединяемого со вставкой и самой вставки подсчитаны в ответе на вопрос 6, процент G и C нуклеотидов (суммарно) в плазмидном фрагменте - 50,47%, во вставке - 60,68% ).
Для плазмиды:
GC состав плазмидного фрагмента — 50.47%, AT — 49.53%.
Общее число нуклеотидов в плазмидном фрагменте: 5011 * 2 = 10022
Количество G + C: 10022 \cdot 0,5047 = \approx 5058, A + T: 10022 - 5058 = 4964
Отсюда:
NG (количество G) = NС = 5058 / 2 = 2529
NA = NT = 4964 / 2 = 2482
Молярная масса (M) = (313.2 \cdot N_A + 329.2 \cdot N_G + 289.2 \cdot N_С +304.2 \cdot N_T) = 3096346 г/моль.
Для вставки:
Общее число нуклеотидов = 740 \cdot 2 = 1480, G + C: 1480 \cdot 0,6068 = 898
A + T: 1480 - 898 = 582
N_G = N_С = 898 / 2 = 449
N_A = N_T = 582 / 2 = 291
М = 449 \cdot 329.2 + 449 \cdot 289.2 + 291 \cdot 304.2 + 291 \cdot 313.2 = 457325 г/моль.
Ответ: 3096346 г/моль и 457325 г/моль
Задание 8. После обработки разрезающими ферментами и очистки обработанных фрагментов ДНК было проведено определение их массовой концентрации, составившей 100 нг/мкл (1.0 \times 10^{-7} г/мкл) для вставки и 2000 нг/мкл (2.0 \times 10^{-6} г/мкл) для линеаризованной плазмиды (большего ее фрагмента). Вычислите количество молей в 1 мкл раствора каждого из фрагментов с использованием рассчитанных в ответе на вопрос 7 значений.
Для справки: 1 г = 106 мкг = 109 нг. 1 моль = 106 мкмоль = 109 нмоль = 1012 пмоль
Помним, что при умножении степеней с одинаковыми основаниями показатели складываются (при делении - вычитаются), основание остается неизменным.
Например: 5 \times 10^{-12} / 10^6 = 5 \times 10^{(-12 - 6)} = 5 \times 10^{-18}
Концентрация (С) вставки = 100 нг / мкл, Сплазмиды = 2000 нг / мкл (дано)
Мвставки = 457325 г/моль (4.573 x 105 г / моль) (из прошлого вопроса)
Мплазмиды = 3096346 g/mol (3.096 x 106 г/моль) (из прошлого вопроса)
количество вещества (v) в 1 ul = C / M для плазмиды:
молярная концентрация (с) = 2.0 x 10-6 г/мкл / 3.096 г/моль = 9,69 x 10-14 моль/мкл (0.097 пмоль / мкл).
для вставки: с = 1.0 x 10-7 г/мкл / 4.573 x 105 г / моль = 0.22 x 10-12 моль / мкл (0.22 пмоль / мкл).
Ответ: 9,69 x 10-14 моль/мкл (0.097 пмоль / мкл)
2.2 x 10-13 моль / мкл (0.22 пмоль / мкл)
Задание 9. В реакцию лигирования решено взять 100 нг линеаризованной плазмиды при молярном соотношении плазмида:вставка = 1 / 5. Сколько микролитров раствора каждого из компонентов необходимо взять в реакцию?
Искомые 100 нг фрагмента плазмиды содержится в: 100 нг / 2000 нг/ul = 0.05 мкл
В таком объем содержится 0.097 пмол/мкл * 0.05 ul = 4,85 x 10-3 пмоль плазмиды (либо 9,69 x 10-14 моль/мкл * 0.05 мкл = 4.85 x 10-15 моль плазмиды).
Значит, чтобы взять вставку в 5-кратном избытке по молям необходимо 4,85x10-3 пмоль * 5 = 2.425 x 10-2 пмоль вставки (2.425 x 10-14 моль вставки).
Чтобы подсчитать необходимый объем вставки, нужно разделить искомое количество вещества на ее молярную концентрацию: 2.425 x 10-3 пмоль / 0.22 пмоль/мкл = 1.1 ul
Ответ: 0.05 мкл и 1.1 мкл
Задание 10. Размножение целевой плазмиды (с внедренным геном GFP) проводим с использованием лабораторного штамма бактерий E. coli. Сначала производят селекцию клеток E. coli, получивших искомую плазмиду, на среде с антибиотиком ампициллин, поскольку у данного штамма нет активного гена, кодирующего фактор устойчивости к этом антибиотику. Подумайте и объясните, зачем необходим ампициллин и почему его присутствие приведёт к отбору тех бактерий, в которые попала искомая плазмида.
Плазмида содержит фактор устойчивости к ампициллину, которого лишены используемые E. coli. Соответственно добавление антибиотика в среду позволит вырастить только те бактерии, в которые плазмида попала при трансформации.