Генный портной

В этом задании вы можете попробовать себя в роли генного инженера. Одной из типичных технических задач в такой работе является перемещение участков ДНК, например, последовательностей каких-либо генов, из одних генетических конструкций в другие, такие как, например, плазмиды - кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, персистирующие и реплицируемые в клетках различных бактерий. Некоторые плазмиды могут персистировать и в клетках эукариот, однако там они обычно не реплицируются.

При "вырезании" участков ДНК, а также при их внедрении в, так называемые, плазмидные векторы, часто используют определенные ферменты, способные вносить разрывы в цепях молекулы ДНК в зависимости от наличия строго определённых последовательностей нуклеотидов. При этом обычно в районе разрезания формируются концевые одноцепочечные участки ДНК - «липкие концы» (некоторые из этих ферментов разрезают без образования «липких концов») (название данных ферментов нужно будет указать в ответах).

Итак, в ходе вашей работы как генного инженера появилась необходимость поместить в имеющуюся плазмиду ген зелёного флуоресцентного белка (GFP). Последовательность действий в общем виде состоит из следующих этапов:

1) Получить в достаточном количестве фрагмент ДНК, соответствующий гену GFP и необходимый для вставки в вектор — плазмиду.

2) Убедиться в точном соответствии нуклеотидной последовательности "вставки" ожидаемой последовательности.

3) Обработать вышеуказанными ферментами отдельно "вставку" и "плазмиду" для получения "липких концов". При этом обработка производится таким образом, чтобы "липкие концы" вставки были комплементарны таковым у плазмиды. При такой обработке плазмиды (разрезании двумя ферментами) в реакционной смеси окажутся два её фрагмента (линейные молекулы ДНК). Меньший из этих фрагментов будет просто отброшен, а больший использован для сшивания его концов с концами вставочного фрагмента. Превращение кольцевой ДНК плазмиды в линейную называем «линеаризацией».

4) Обработка смеси «порезанных» плазмиды и вставки ферментом ДНК-лигаза, катализирующим образование фосфодиэфирной связи между 5' и 3' концами двухцепочечных ДНК ("сшивает" одноцепочечные разрывы, остающиеся после комплементарного взаимодействия "липких концов"). В результате в смеси должны появиться целевые плазмиды со вставкой (восстанавливается кольцевая форма).

5) Для селективного накопления таких плазмид проводят их клонирование в бактериях (обычно E. coli) с последующим выращиванием проверенных клонов в большом объёме.

В нашем случае молекулы вставки получены в необходимых количествах заранее с добавленными на обоих концах дополнительными нуклеотидными последовательностями, не относящимися к кодирующей последовательности и не участвующими в экспрессии кодируемого гена (GFP), но содержащие в себе сайты узнавания вышеупомянутыми ферментами. Ниже на схеме представлена последовательность (не полная, только концевые участки) вставки. Пробелы между триплетами присутствуют только для удобства изучения последовательности.

Кроме того, имеется результат секвенирования (определение первичной последовательности ДНК) участка плазмиды, в который предполагается интегрировать вышеуказанный фрагмент ДНК. Было проведено секвенирование по Сэнгеру с помощью автоматического капиллярного секвенатора. На выходе получена секвенограмма в виде "сырой", непрочитанной программой хроматограммы, где пики четырёх цветов соответствуют различным нуклеотидам (см. легенду). На изображении 2 представлен интересующий участок секвенограммы плазмиды, на протяжении которого нужно осуществить вставку последовательности гена GFP.

Таблица 1. Сайты узнавания некоторых ферментов, позволяющих сайтспецифически разрезать молекулы двухцепочечной ДНК

Задание 1. Где в бактериальной клетке следует искать плазмидную ДНК? Несмотря на отсутствие репликации плазмид в клетках многоклеточных эукариотических организмов, некоторые из генов, кодируемых в плазмидах, могут там экспрессироваться (при искусственном введении плазмиды в такие клетки). Обычно это зависит от наличия в плазмиде перед геном соответствующего управляющего элемента, подходящего именно для эукариотических клеток. Назовите этот управляющий элемент.