Задача
Прочитайте внимательно текст.
После ответьте на вопросы. В 1978 Нобелевскую премию получили В. Арбер, Д. Натанс и Х. Смит «за обнаружение рестрикционных ферментов и их применение в молекулярной биологии».
Эти ферменты являются составной частью системы рестрикции-модификации (RМ) широко распространенной среди прокариотических организмов. Система состоит из двух видов ферментативных активностей. Один из ферментов осуществляет метилирование ДНК, которое обеспечивает модификацию оснований А или Ц в пределах определенной последовательности ДНК. Эта сайт-специфическая модификация защищает ДНК хозяина от действия другого фермента данной системы - рестриктазы, который обладает эндонуклеазной активностью. Каждая рестриктаза узнает свой специфический сайт (короткую палиндромную последовательность ДНК из 4-10 пар нуклеотидов) – и вносит там разрыв. Биологической функцией полных систем RМ обычно считается защита генома хозяина от внедрения чужеродной ДНК, в частности ДНК бактериофага.
1) Определите, какие из приведенных ниже клеток, имеющих разные комбинации элементов системы рестрикции-модификации, будут жизнеспособны и устойчивы к фагам и почему:
а) R(+) M(+)
б) R(+) M(-)
в) R(-) M+
г) R(-) M(-)
где R(+) – рестрикционная активность, M(+) – метилирующая активность, R(-) – отсутствие рестрикционной активности M(-) – отсутствие метилирующей активности
2) Какие из представленных четырех типов клеток удобны для использования в генной инженерии? Ответ поясните.
а)
1) Клетка жизнеспособна и устойчива к фагам, так как собственная ДНК будет метилирована, то есть защищена от действия своих рестриктаз, но при этом рестриктаза будет расщеплять чужеродную ДНК, например ДНК бактериофага.
2) Клетка не жизнеспособна, так как при сохранении рестрикционной активности и отсутствии метилирующей, ДНК не будет защищена от действия своих рестриктаз.
3) Неустойчивость к фагам, так как нет рестрикционной активности, но при этом будет жизнеспособна.
4) Неустойчивость к фагам, так как нет рестрикционной активности, но при этом будет жизнеспособна.
б)
Большинство лабораторных штаммов, с которыми работают генные инженеры R- M- или R-M+, так как при отсутствии рестрикционной активности появляется возможность вводить в такие клетки чужеродную ДНК, например плазмиды.
3) Известна последовательность нуклеотидов одной цепи линейной ДНК аденовируса
3' ААЦТТААГАЦАГТТТАТАТТАЦГГЦАГЦГГТГАЦГЦГГГЦТ... 5'
и сайты рестрикции трех рестриктаз: HpaI, EcoRI, HindIII:
Какая из этих рестриктаз способна расщепить представленный выше участок ДНК? Какие фрагменты двухцепочечной ДНК при этом образуются? Укажите сайт распознавания рестриктазы и полученные фрагменты ДНК.
4) При рестрикции ДНК аденовируса (длина – 32362 пар оснований) рестриктазой А получили фрагменты длиной: 15964, 10034 и 6364 п. о. Сколько специфических сайтов узнает рестриктаза А в данной ДНК аденовируса? Сколько фрагментов получилось бы при рестрикции той же самой последовательности, но плазмидной ДНК. Почему?
5) Определите массу фрагмента длиной 10034 п.о., если известно, что масса исходной ДНК составляла 20 мкг. Ответ округлите до целого числа.
в) EcoRI
г) 2 сайта. При рестрикции плазмидной ДНК получилось бы 2 фрагмента, так как плазмида – кольцевая молекула.
д) 6 мкг