Задача
«Вирусы - это нежить живого мира,
Зомби древнейших геологических эпох.
Никому не ведомо происхождение вирусов,
Как и на каком этапе истории жизни
На Земле они зародились».
Ричард Престон
В этом задании мы предлагаем Вам ответить на ряд вопросов из области вирусологии.
Задание 1. А) Элементарной инфекционной частицей вируса является вирион. Какое важнейшее отличие вирионов любых вирусов от клеточных форм, даже самых примитивных, вы можете назвать? Какие свойства вирусов дают основание не относить их к жизненным формам? Б) Каковы основные структурные элементы вириона, какие классы веществ входят в их состав?
1А Очевидное важнейшее отличие вирусов от клеточных форм - отсутствие клеточного уровня организации. Из этого следуют и те свойства вирусов, которые позволяют рассматривать их не как жизненные формы - при нахождении вне клетки хозяина вирусы совершенно лишены какой-либо биологической активности. У них нет самостоятельного метаболизма, они не растут и не могут самостоятельно размножаться.
1Б Основные структурные элементы, входящие в состав вириона любого вируса - геномная нуклеиновая кислота (вирусный геном) и капсид (вместе с геномом - нуклеокапсид). У разных вирусов могут быть дополнительные структурные элементы, такие как внешняя оболочка, различные фибриллы (как у бактериофагов) и пр. Основные классы веществ, входящие в состав любых вирусов, - нуклеиновые кислоты и белки. Также, в случае оболочечных вирусов, - липиды. Встречаются липопротеины, гликопротеины и пр.
Задание 2. А) Какое главное отличие оболочечных и безоболочечных вирусов? Верно ли утверждение, что последние лишены любых иных структурных элементов помимо непосредственно вирусного генома? (ответ поясните). В результате какого процесса оболочечные вирусы получают свою оболочку и из чего она главным образом состоит? Б) Какой термин, характеризующий ход процесса, используют при описании общих закономерностей того, как образуются зрелые вирионы?
2А Наличие оболочки, формирующейся вокруг вирусных нуклеопротеидов из ЦПМ клетки-хозяина - главное и очевидное отличие оболочечных от безоболочечных вирусов. Получают они эту оболочку в процессе "почкования" - когда прикрепленные к ЦПМ с внутренней стороны нуклеопротеиды выходят в "пузырьке" из мембраны из клетки наружу. Таким образом, оболочка таких вирусов состоит в основном из элементов ЦПМ (двойной слой липидов, трансмембранные белки и пр.) дополненных в ряде случаев специфическими вирусными белками, которые были предварительно интегрированы в ЦПМ в месте почкования.
2Б Нуклеопротеиды вирусов (нуклеокапсиды), как и капсиды сами по себе (пустые) обладают способностью к так называемой самосборке. Именно этот процесс и лежит в основе сборки вирусных частиц.
Задание 3. А) Какие отличия от клеточных форм имеются у вирусов в плане использования нуклеиновых кислот в процессе передачи наследственной информации? (у абсолютного большинства только один вид нуклеиновых кислот в качестве генома, может быть как ДНК, так и РНК) Б) Какими функциональными типами РНК могут быть представлены геномы РНК-содержащих вирусов? Очищенная РНК каких вирусов (какой тип РНК-геномов) может проявлять инфекционность? Почему?
3А В отличие от клеточных форм, у вирусов обычно присутствует один какой-то типа нуклеиновой кислоты РНК или ДНК. С другой стороны, в отличие от всех клеточных форм, вирусный геном может быть представлен как молекулами ДНК, так и РНК. Причем разнообразие типов РНК и ДНК у вирусов даже шире, чем у клеточных форм. Так у вирусов встречаются как кольцевые, так и линейные двух- и одноцепочечные ДНК, двух- и одноцепочечные РНК. Это только в составе вириона. В процессе репликации вируса в клетке, в некоторых случаях могут быть обнаружены кольцевые молекулы РНК.
3Б Функциональные типы РНК у РНК-содержащих вирусов - это (+)РНК и (-)РНК. Первые могут быть использованы как мРНК для прямой трансляции белков на рибосомах хозяина, вторые для синтеза кодируемых белков требуют предварительного ферментативного получения (+)-нитевых информационных иРНК, с использованием вирусных РНК-репликаз. Очищенная геномная РНК вирусов с (+)РНК геномом является инфекционной (хотя и в меньшей степени, чем целые вирионы) т.к. способна сразу, без задействования ферментов в составе вириона (которых в случае очищенной РНК и нет), стать матрице для синтеза вирусных белков.
Задание 4. А) Известно, что средние уровни возникновения мутаций в ходе репликации РНК-содержащих вирусов значительно превышают таковые для ДНКсодержащих. Какие явления или характеристики называют основными причинами таких различий? Б) Какое преимущество может давать высокий уровень возникновения мутаций вирусам.
4А В отличие от ферментов, задействованных в репликации ДНК, ферменты, обеспечивающие репликацию вирусной РНК (собственные РНКполимеразы) в основном не обладают способностью корректировать ошибки, связанные с встраиванием "неправильных" нуклеотидов - отсутствует 3'- экзонуклеазная активность. Это, по-видимому, приводит к более высокой частоте мутаций у РНК-содержащих вирусов.
4Б Высокий уровень возникновения мутаций с одной стороны может позволять адаптироваться к новым условиям, избегать действия защитных механизмов хозяина. Например в поверхностных белках вирусов, являющихся основными антигенами, частота фиксации мутаций может быть значительно выше по сравнению с более консервативными внутренними структурными белками и ферментами в составе вириона. Однако частота мутаций все-же должна быть сбалансированной, в противном случае каждая мутация, дающая конкурентное преимущество, может сопровождаться дополнительными мутациями, снижающими или делающими невозможной "выживаемость" несущего ее вирусного "потомства".
Задание 5. А) Существует закономерность, заключающаяся в том, что для высокоспециализированных вирусов, глубоко приспособленных к паразитированию в клетках определенного хозяина, часто характерно менее выраженное негативное влияние на здоровье хозяина, нежели у вирусов, сравнительно недавно "научившихся" поражать какой-либо вид. Подумайте, чем может объясняться подобная закономерность. Б) Вышеуказанная закономерность, однако, в реальности наблюдается далеко не всегда, поскольку имеется множество дополнительных факторов, которые должен "учесть" вирус, выбирая оптимальную стратегию в отношении хозяина. Подумайте, какие факторы влияют на "выбор" оптимальной стратегии.
5А Данная закономерность объясняется тем, что в целом, при игре "в долгую" для вируса невыгодно "убивать" хозяина, так как при этом как сокращается количество объектов, пригодных для поддержания вирусной популяции, так и может становиться затрудненной передача вируса. Поэтому эволюционное преимущество получают варианты вируса, которые не провоцируют такое неблагоприятное для их сохранения развитие событий
5Б То, что такая закономерность проявляется не всегда может быть объяснено наличием множества дополнительных факторов, которые делают систему более сложной. Высокая плотность популяции (хозяина) снижает необходимость в оптимальной стратегии, зависимость факторов трансмиссивности и патогенности вынуждает вирус "идти на издержки" связанные с уменьшением "кормовой базы" так как возможность эффективно распространяться оказывается важнее. Исходная высокая трансмиссивность при большом объеме популяции хозяина также позволяет вирусу "пренебрегать" адаптацией к организму хозяина со снижением патогенного эффекта, т.к. вирус успеет распространиться даже в случае быстрой смерти носителя.
Задание 6. А) Геном некоторых вирусов, таких как вирусы гриппа - сегментированный. У вирусов гриппа А и B имеется по 8 молекул РНК, у вируса гриппа С - 7. Вышеуказанная сегментированность делает возможным интересное явление, называемое реассортацией и заключающееся в том, что при попадании в одну клетку разных вирусов гриппа, может происходить "смешивание" сегментов генома "родительских" вирусов в вирусном потомстве. Так могут возникать вирусы гриппа с новыми свойствами, меняться спектр чувствительных хозяев. Зная это попробуйте решить следующую задачу: предположим в организм свиньи попали два разных вируса гриппа А (упрощенно считаем, что в среднем в каждую инфицированную клетку попадают вирионы разных вирусов в примерно равных количествах). Один из вирусов - вирус гриппа человека с низкой вирулентностью, но достаточно высокой трансмиссивностью. Второй - высоковирулентный вирус гриппа птиц. Известно, что вирулентность и специфичность в отношении хозяина определяется взаимодействием между собой (разными путями) продуктов генов вируса и внутри одного вируса гены очевидно наиболее "подогнаны" друг к другу. Вопрос - какова вероятность возникновения высоко вирулентного вирусного потомства, способного инфицировать человека, если известно, что за спектр хозяев в первую очередь отвечают продукты генов, занимающих 4 и 6-й геномные сегменты - гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (N). Упрощенно считаем, что вирулентность определяется сочетанием остальных генов (один сегмент геном - один (или два) гена). При решении не учитываем факторы отбора и факторы, связанные с функциональным несоответствием генов от разных родительских вирусов, все сочетания сегментов - случайны.
Б) Вышеупомянутая реассортация является причиной такого явления как антигенный сдвиг, резко меняющий антигенные свойства вируса при замене сегментов, кодирующих главные поверхностные антигены гемагглютинин и нейраминидазу. Это явления относительно редкое, однако имеется другой вариант антигенной изменчивости, характерной, в том числе, для вирусов гриппа. Что это за вариант? Чем он вызван и чем характеризуется? Как эти два варианта антигенной изменчивости влияют на актуальность вакцин?
6А Вероятность получения каждого из сегментов от одного из родительских вирусов составляет 1/2 при условии, что геномный сегмент с каждым номером из 8 будет присутствовать в гибридном вирионе, но будет взят от одного из 2 родительских вирусов. Тогда вероятность 2 сегментов взятых от одного из родительских 1/2 * 1/2, а вероятность всех остальных, взятых от второго вируса (1/2) в степени 6. Поскольку все события независимые, то вероятности нужно перемножить, итого: (1/2) в степени 8 составит 1/256 или 0,00390625. Это число и будет ответом (1 балл).
6Б Другой вариант изменчивости у вируса гриппа (возможна и у других вирусов) - это антигенный дрейф, при котором происходит постепенное накопление таких мутаций, которые имеют фенотипическое (а конкретнее - антигенное) проявление. Вызваны такие мутации, по-видимому, преимущественно ошибками репликации, а также, возможно, отчасти мутагенными факторами внешней среды. Если антигенный дрейф приводит к постепенному устареванию вакцин, при котором формируемый ими иммунитет все-еще позволяет какое-то время защищаться от "дрейфующих" вариантов вирусов, то антигенный сдвиг делает неактуальные вакцины бесполезными, т.к. приводит к полной замене антигенов (1 балл).
Задание 7. A) Что из себя представляют неспецифические и специфические противовирусные защитные механизмы у человека и высших животных? Какие основные иммунные механизмы (специфические защитные механизмы) задействованы в противовирусной защите? Б) Какие механизмы противовирусной защиты имеются у растений? У бактерий?
7А. К неспецифическим защитным механизмам у человека и высших животных можно отнести систему интерферонов - группа белков, синтезируемых клеткой в ответ на вирусную инфекцию и блокирующих репликацию вируса в клетке, а также стимулируют активацию защитных механизмов соседних клеток. Клетки "натуральные киллеры" уничтожают клетки, на поверхности которых обнаруживаются несвойственные им белки, кодируемые вирусом. Макрофаги выполняют функцию фагоцитоза, поглощая и уничтожая различные частицы, в том числе вирусы (хотя иногда сами могут становиться хозяевами для этих вирусов). К специфическим защитным противовирусным механизмам у человека и высших животных относят системы гуморального иммунитета (связанного с выработкой специфических нейтрализующих антител против антигенов вируса) и клеточного иммунитета. Основными эффекторами клеточного противовирусного иммунитета являются Т-цитотоксические лимфоциты (CD8+-клетки).
7Б. У растений обнаруживают такие механизмы противовирусной защиты, как РНК-интерференция, активация экспрессии генов устойчивости (R-гены) и активация PR-белков, синтезирующихся в ответ на различные инфекции. Под РНК-интерференцией подразумевается система, в которой двухцепочечные (на определенном этапе) вирусные РНК разрезаются специальным белком (dicer) на короткие двухцепочечные РНК, одна из цепей которых затем, в составе RISC комплекса участвует в нахождении (по принципу комплементарности) и инактивации (разрезании белками участниками комплекса) вирусных РНК. У бактерий среди защитных противофаговых механизмов можно назвать систему CRISPR/Cas, систему эндонуклеаз рестрикции и некоторые другие.
Задание 8. А) Выявление вирусной инфекции в организме возможно различными лабораторными методами. Среди прочих достаточно эффективны так называемые серологические методы. Что это за методы (требуется не перечислить, а объяснить, что они собой представляют)? Б) Какие два направления по выявляемому объекту можно выделить в этой группе методов?
8А. Серологическими называют методы в основе действия которых лежит взаимодействие антиген-антитело.
8Б. Прямые методы используются с известными антителами для поиска соответствующих антигенов, непрямые используют для поиска антител с использованием известного антигена - данные методы позволяют выявлять развивающееся заболевание в тех случаях, когда возбудитель обнаружить в крови сложно.
Задание 9. А) При изучении различных свойств выявляемых вирусов, разработке методов лекарственной терапии, получении вакцинных штаммов и для множества иных целей бывает необходимо пассировать эти вирусы в лаборатории. При этом необходимо проводить количественную оценку получаемых вирусных препаратов с точки зрения их концентрации - титр вируса. Пассажи вирусов гриппа часто проводят на куриных эмбрионах, при этом титр можно определять в простейшей реакции гемагглютинации (РГА). Для ее постановки предварительно во все лунки специального серологического планшета с круглодонными лунками (рис B) вносится по 1 объему буферного раствора (0,15 М NaCl, 0,01 М Tris-HCl, pH 7,2), затем, туда же, вносят анализируемый вирусный препарат последовательными двукратными разведениями. Для этого в первую лунку по горизонтали вносится 1 объем взвеси вируса, перемешивается, и объем, равный внесенному, переносится в следующую лунку. Таким образом делаются последовательные разведения во всей линии лунок, из последней лунки в линии после перемешивания удаляется объем равный вносимому. К разведениям вирусного препарата в лунках планшета добавляют равный объем взвеси куриных эритроцитов (1%) и проводят инкубацию (30 мин). Гемагглютинин вируса гриппа позволяет ему связываться с поверхностью клетки, в том числе эритроцита. Из-за этого происходит связывание вирусами эритроцитов в агрегаты. Там, где РГА не прошла, эритроциты в круглодонных лунках скапливаются на дне в виде яркого локального кружка (рис C), там, где РГА прошла, обнаруживаются специфические "зонтики" агрегатов эритроцитов (рис D). В качестве титра вируса берут величину обратную последнему разведению вируса, которое еще дает гемагглютинацию. Титр, соответственно, выражают в гемагглютинирующих единицах (ГАЕ). Посмотрите на рис. E и скажите, какие титры показывает РГА. Для простоты - частичную гемагглютинацию считаем полной.
Б) Попробуем оценить количество вирионов в препаратах. Известно, что одна гемагглютинирующая единица составляет порядка (104 – 106 ) вирионов. Оцените количество вирионов в препаратах, титровавшихся на рис E (от минимального значения - до максимального значения) в тех объёмах, которые были внесены в первые лунки (0.5 мл)
9А. Смотрим на номер лунки, в которой еще наблюдается агглютинация - n Тогда разведение = 1/2n, а количество ГАЕ в исходном объеме вирусного препарата (титр) = 2^(n) (величина обратная разведению) V1 - 256 ГАЕ, V2- 16ГАЕ, V3 - 256ГАЕ, V4 - 4ГАЕ (1 балл).
9Б. Умножаем титр на количество вирионов в 1ГАЕ:
V1 минимум - 256 * 1.0E+4 = 2 560 000 вирионов в 0.5 мл или 5 120 000 вирионов в мл.
V1 максимум - 256 * 1.0E+6 = 256 000 000 вирионов (512 000 000 в мл)
V2 - от 160 000 до 16 000 000 (320 000 - 32 000 000)
V3 - от 2 560 000 до 256 000 000 (5 120 000 - 512 000 000)
V4 - от 40 000 - до 4 000 000 (80 000 - 8 000 000)
Задания 10. А) При создании противовирусных вакцин для человека в настоящее время используется множество разных подходов. "Классические" методы включали либо использование слабо вирулентных для человека вирусов, близких к тому, против которого создается вакцина, либо использование искусственно ослабленных (аттенуированных) штаммов. Назовите ученого, впервые осознанно использовавшего первый подход, с каким вирусным заболеванием он (достаточно успешно) пытался бороться? Какой вирус был использован в качестве вакцинного? Б) Кто был "изобретателем" подхода к созданию вакцин, построенного на искусственном ослаблении изначально высоко вирулентного вируса? Что за вирус он таким способом ослаблял? Какой метод был положен в основу подхода? В чем он заключается?
10А. Ученый: Эдвард Дженнер. Вирусное заболевание: Оспа. Вирус, использованный в качестве вакцинного: Вирус коровьей оспы.
10Б. Луи Пастер искал способ борьбы с таким заболеванием, как бешенство, вызываемое, соответственно вирусом бешенства. Для создания вакцинного штамма Пастер изобрёл способ "аттенуирования" вируса посредством многократного пассирования его в организме слабочувствительных к нему кроликов, получив с использованием этой методики вакцинный штамм.